Film X-Men membuka cerita dengan kilas balik ke tahun 1944 di Polandia yang diduduki Nazi. Seorang anak laki-laki Yahudi bernama Erik Lehnsherr muda terpisah dari orang tuanya di kamp konsentrasi Auschwitz. Dalam keputusasaannya untuk meraih mereka, kekuatan mutan dalam dirinya bangkit, membengkokkan gerbang besi di sekitarnya. Kejadian ini membuatnya pingsan, namun menandai awal dari kekuatan dahsyat yang dimilikinya.
Beranjak ke masa kini, dunia dihadapkan pada isu keberadaan mutan, individu dengan kemampuan genetik luar biasa. Senator Amerika Serikat, Robert Kelly, menggagas “Undang-Undang Pendaftaran Mutan” yang kontroversial. Undang-undang ini mewajibkan semua mutan untuk mengungkapkan identitas dan kekuatan mereka kepada pemerintah. Di tengah perdebatan sengit mengenai undang-undang ini, Charles Xavier, seorang mutan telepati yang kuat, merasakan kehadiran Erik Lehnsherr, yang kini dikenal sebagai Magneto, di tengah hiruk pikuk politik tersebut. Xavier khawatir dengan reaksi Magneto terhadap potensi undang-undang yang diskriminatif ini.
Di Meridian, Mississippi, seorang gadis remaja bernama Marie tanpa sengaja menyebabkan koma pacarnya setelah menciumnya. Marie ternyata adalah seorang mutan dengan kemampuan menyerap kekuatan dan energi kehidupan orang lain. Ketakutan dan kebingungan, Marie melarikan diri dan mengganti namanya menjadi Rogue. Di perjalanan pelariannya ke Alberta, ia bertemu dengan Logan, seorang mutan yang lebih dikenal sebagai Wolverine. Wolverine memiliki kemampuan penyembuhan super cepat dan cakar logam yang muncul dari tangannya. Pertemuan mereka tidak berjalan mulus, karena mereka diserang oleh Sabretooth, mutan buas yang merupakan anggota Brotherhood of Mutants pimpinan Magneto. Untungnya, dua anggota X-Men, Cyclops dan Storm, datang tepat waktu untuk menyelamatkan Rogue dan Wolverine.
Cyclops dan Storm membawa Rogue dan Wolverine ke sekolah khusus mutan milik Xavier di Westchester County, New York. Xavier, yang merasa Magneto mungkin tertarik pada Wolverine karena sesuatu hal, meminta Logan untuk tinggal sementara di sekolahnya untuk menyelidiki lebih lanjut. Sementara itu, Rogue mulai beradaptasi dengan kehidupan barunya di sekolah dan menaruh hati pada Bobby Drake, seorang mutan muda dengan kekuatan cryokinesis atau kemampuan mengendalikan es.
Konflik semakin memanas ketika anggota Brotherhood of Mutants, Toad dan Mystique, menculik Senator Kelly. Mereka membawa Kelly ke tempat persembunyian mereka di pulau terpencil Genosha. Magneto menggunakan Kelly sebagai kelinci percobaan untuk mesin ciptaannya yang ditenagai oleh kekuatan magnetiknya. Mesin ini menghasilkan radiasi yang dapat memicu mutasi pada manusia normal. Kelly, yang sekarang memiliki kekuatan mutan baru, berhasil melarikan diri.
Suatu malam, Rogue mengunjungi Logan yang sedang bermimpi buruk. Logan yang terkejut secara tidak sengaja melukai Rogue dengan cakarnya. Namun, Rogue secara tidak sengaja menyerap kemampuan penyembuhan Logan dan lukanya sembuh dengan cepat. Sementara itu, Mystique, yang mampu mengubah wujud, menyamar menjadi Bobby Drake dan memanipulasi Rogue. Mystique meyakinkan Rogue bahwa Xavier marah padanya dan ia harus meninggalkan sekolah. Xavier menggunakan Cerebro, mesin pendeteksi mutan, untuk mencari Rogue yang berada di stasiun kereta. X-Men segera bergerak untuk menjemputnya. Tanpa disadari, Mystique menyusup ke Cerebro dan menyabotase mesin tersebut.
Logan, yang berangkat lebih dulu dari Storm dan Cyclops, menemukan Rogue di kereta dan berhasil membujuknya untuk kembali ke sekolah. Namun, sebelum mereka sempat pergi, Magneto muncul dan melumpuhkan Logan. Magneto mengungkapkan bahwa target utamanya bukanlah Logan, melainkan Rogue. Xavier mencoba menghentikan Magneto dengan mengendalikan Sabretooth melalui telepati, namun Magneto mengancam polisi yang telah tiba di stasiun. Xavier terpaksa melepaskan kendalinya, dan Brotherhood of Mutants berhasil melarikan diri dengan membawa Rogue.
Senator Kelly yang berhasil kabur tiba di sekolah Xavier. Xavier membaca pikiran Kelly untuk mengetahui rencana Magneto dan mesin mutasinya. Mereka menyadari bahwa mesin tersebut hampir membunuh Kelly dan Magneto berencana untuk mentransfer kekuatannya ke Rogue agar ia dapat mengoperasikan mesin tersebut dengan kekuatan penuh, meskipun dengan resiko kematian Rogue. Tubuh Kelly menolak mutasi paksa tersebut, dan tubuhnya perlahan mencair menjadi cairan. Xavier mencoba menggunakan Cerebro untuk menemukan Rogue, tetapi sabotase Mystique membuat mesin tersebut tidak berfungsi dan membuat Xavier jatuh koma. Jean Grey, seorang mutan telepati dan telekinetik, berhasil memperbaiki Cerebro dan menggunakannya. Ia menemukan bahwa Brotherhood of Mutants berencana menempatkan mesin mereka di Pulau Liberty dan menggunakannya untuk “memutasi” para pemimpin dunia yang sedang berkumpul di KTT di Pulau Ellis.
X-Men segera menuju Patung Liberty dan terlibat pertempuran sengit dengan Brotherhood of Mutants. Sementara itu, Magneto berhasil mentransfer kekuatannya ke Rogue dan mengaktifkan mesin tersebut. Logan menghadapi Magneto untuk mengalihkan perhatiannya, sementara Cyclops berhasil melumpuhkan Magneto. Logan kemudian menghancurkan mesin tersebut. Dalam tindakan heroik terakhir, Logan mentransfer kembali kekuatannya kepada Rogue, membuatnya pulih namun membuat dirinya tidak berdaya.
Xavier dan Logan pulih dari koma mereka. X-Men mengetahui bahwa Mystique berhasil melarikan diri dari pertempuran di Pulau Liberty dan menyamar menjadi Senator Kelly. Xavier memberi Logan petunjuk tentang masa lalunya di sebuah instalasi militer terbengkalai di Kanada. Di akhir cerita, Xavier mengunjungi Magneto yang kini dipenjara di kompleks khusus yang terbuat dari polikarbonat. Magneto memperingatkan Xavier bahwa ia akan melarikan diri suatu hari nanti dan melanjutkan perjuangannya. Xavier menjawab bahwa ia akan selalu ada untuk menghentikannya.
