Film The Amazing Spider-Man 2, produksi Marvel, melanjutkan kisah Peter Parker dalam menjalani peran gandanya sebagai siswa SMA dan pahlawan super Spider-Man. Film ini dibuka dengan adegan kilas balik yang mengungkap misteri menghilangnya orang tua Peter, Richard dan Mary Parker. Richard, seorang ilmuwan Oscorp, merekam pesan video menjelaskan alasan pelariannya sebelum pesawat yang mereka tumpangi dibajak dan jatuh, menewaskan keduanya.
Dua tahun kemudian, Peter Parker masih aktif memberantas kejahatan sebagai Spider-Man. Setelah berhasil menangkap penjahat Rusia bernama Aleksei Sytsevich, Peter harus menghadapi masalah lain: hubungannya dengan Gwen Stacy. Peter dihantui janji kepada ayah Gwen untuk menjauhi putrinya demi keselamatannya. Meskipun saling mencintai, Gwen akhirnya memutuskan hubungan mereka setelah lulus SMA.
Kehidupan Peter semakin rumit dengan kembalinya sahabat masa kecilnya, Harry Osborn. Harry kembali ke New York untuk menjenguk ayahnya, Norman Osborn, CEO Oscorp yang sakit parah. Norman mengungkapkan bahwa penyakitnya bersifat genetik dan Harry berisiko mengalaminya di usia yang sama. Setelah kematian Norman, Harry mewarisi jabatan CEO Oscorp dan warisan penyakit mematikan tersebut.
Di Oscorp, seorang insinyur listrik bernama Max Dillon mengalami kecelakaan saat bekerja di laboratorium. Ia terjatuh ke dalam tangki berisi belut listrik hasil rekayasa genetika dan bermutasi menjadi makhluk bertenaga listrik yang kemudian dikenal sebagai Electro. Sementara itu, Gwen mendapat kabar baik sekaligus membingungkan: ia diterima beasiswa di Oxford University, Inggris. Kabar ini membuat Peter dan Gwen mempertimbangkan masa depan hubungan mereka.
Electro, yang belum menyadari sepenuhnya kekuatannya, tidak sengaja menyebabkan pemadaman listrik besar di Times Square. Spider-Man datang untuk menghentikannya dan berhasil meringkus Electro. Electro kemudian dibawa ke Ravencroft Institute untuk diteliti oleh Dr. Ashley Kafka.
Harry, yang mulai merasakan gejala penyakit ayahnya, yakin bahwa darah Spider-Man dapat menyelamatkannya. Ia meminta bantuan Peter, yang selama ini menjual foto-foto Spider-Man ke Daily Bugle, untuk menemukan Spider-Man. Peter ragu dan khawatir transfusi darah tersebut akan memberikan efek samping berbahaya seperti yang dialami Dr. Connors. Ia menolak permintaan Harry sebagai Spider-Man, membuat Harry marah dan merasa dikhianati.
Donald Menken, wakil presiden Oscorp, memanfaatkan situasi ini untuk menjebak Harry atas insiden kecelakaan Dillon. Harry dipecat dari jabatannya sebagai CEO dan Menken mengambil alih Oscorp. Dalam keputusasaannya, Harry menawarkan kesepakatan kepada Electro untuk membantunya masuk kembali ke Oscorp. Electro setuju dan bahkan membunuh Dr. Kafka dalam prosesnya.
Di Oscorp, Harry menemukan bisa dari laba-laba hasil rekayasa genetika Norman. Ia memaksa Menken untuk menyuntikkan bisa tersebut ke tubuhnya. Bisa itu memperparah penyakitnya dan mengubahnya menjadi makhluk mengerikan seperti goblin. Namun, setelan armor eksperimental yang ia kenakan berhasil menstabilkan kondisinya, menjadikannya Green Goblin.
Peter menemukan laboratorium rahasia Richard Parker di stasiun kereta bawah tanah yang terbengkalai. Di sana, ia mengetahui bahwa ayahnya melarikan diri karena menolak rencana Norman untuk menggunakan penelitiannya dalam pembuatan senjata biogenetik. Peter juga menemukan fakta bahwa Richard menggunakan DNA-nya sendiri saat menciptakan laba-laba, sehingga Oscorp tidak dapat mereplikasi mereka tanpa darah Peter.
Setelah meninggalkan lab, Peter mengetahui bahwa Gwen menerima beasiswa Oxford. Ia menyatakan cintanya pada Gwen dan mereka sepakat untuk pindah ke Inggris bersama. Sayangnya, kebahagiaan mereka tidak berlangsung lama.
Electro kembali beraksi dan menyebabkan pemadaman listrik lain. Spider-Man dan Gwen bekerja sama untuk memulihkan daya dan akhirnya berhasil mengalahkan Electro dengan membebani tubuhnya dengan listrik berlebihan hingga tewas. Namun, kemunculan Green Goblin mengubah segalanya. Melihat Gwen, Harry menyadari identitas rahasia Spider-Man dan bersumpah balas dendam karena penolakan transfusi darah. Ia menculik Gwen ke puncak menara jam dan menjatuhkannya.
Meskipun Spider-Man berhasil mengalahkan Green Goblin, ia tidak mampu menyelamatkan Gwen. Kematian Gwen menghancurkan Peter. Dipenuhi rasa bersalah dan depresi, Peter mengakhiri karirnya sebagai Spider-Man.
Lima bulan kemudian, Harry dipenjara di Ravencroft dan berjuang dengan efek samping transformasinya. Gustav Fiers, kaki tangannya, mengunjunginya dan mereka membahas pembentukan tim mereka sendiri. Harry memerintahkan Fiers untuk memulai dengan Sytsevich, yang telah dibantunya melarikan diri. Sytsevich, kini mengenakan setelan armor elektromekanis, menyebut dirinya Rhino dan mengamuk di jalanan kota. Peter, terinspirasi kembali oleh pidato kelulusan Gwen yang ia tonton, kembali sebagai Spider-Man untuk menghadapi Rhino.
