Spider-Man 3: Tiga tahun setelah peristiwa heroik melawan Doctor Octopus, Peter Parker kini menikmati kehidupannya sebagai Spider-Man yang dicintai sekaligus merencanakan masa depan dengan Mary Jane Watson. Mary Jane sendiri tengah meniti karir di Broadway, mewujudkan impiannya. Kehidupan mereka tampak sempurna, namun badai segera datang.
Suatu malam romantis di Central Park, meteor jatuh tak jauh dari tempat Peter dan Mary Jane berkencan. Dari meteor tersebut, muncul cairan hitam misterius, sebuah symbiote alien, yang secara diam-diam mengikuti Peter hingga ke apartemennya, menempel di motornya tanpa disadari.
Di saat yang sama, Harry Osborn, sahabat Peter yang masih dirundung duka dan dendam atas kematian ayahnya, Norman Osborn, kembali muncul. Harry meyakini Spider-Man bertanggung jawab atas kematian ayahnya dan bertekad untuk membalas dendam. Dengan menggunakan serum peningkat performa dan teknologi Green Goblin milik ayahnya, Harry menyerang Peter. Pertarungan sengit terjadi di udara, berakhir dengan keduanya terjatuh. Harry mengalami amnesia parsial akibat benturan keras.
Sementara itu, di tempat lain, Flint Marko, seorang narapidana yang kabur, berusaha menemui istri dan putrinya yang sakit. Dalam pelariannya, ia secara tidak sengaja terjatuh ke dalam fasilitas penelitian partikel yang sedang diuji coba. Tubuhnya terpapar partikel eksperimental dan menyatu dengan pasir di sekitarnya. Kejadian ini mengubah Marko menjadi Sandman, manusia pasir dengan kemampuan mengendalikan dan mengubah tubuhnya menjadi pasir.
Sebuah festival diadakan untuk menghormati Spider-Man atas aksi heroiknya menyelamatkan Gwen Stacy. Peter, yang terbawa suasana, mencium Gwen di depan publik, membuat Mary Jane terluka dan cemburu. Tak lama setelah itu, Sandman melakukan perampokan truk lapis baja, memicu pertempuran dengan Spider-Man. Kapten Polisi George Stacy, ayah Gwen, mengungkapkan fakta mengejutkan kepada Peter dan Bibi May: Flint Marko adalah pembunuh sebenarnya Paman Ben, bukan hanya kaki tangan seperti yang diperkirakan sebelumnya.
Saat menunggu Sandman muncul kembali, symbiote alien menemukan Peter yang tertidur dan menyatu dengan kostum Spider-Man. Peter terbangun di atas gedung dengan kostum Spider-Man yang kini berwarna hitam. Ia menyadari kekuatannya meningkat secara signifikan, namun bersamaan dengan itu, sisi agresif dan gelap dalam dirinya juga ikut menguat.
Pertarungan sengit antara Spider-Man dan Sandman kembali terjadi di kereta bawah tanah. Peter menemukan kelemahan Sandman terhadap air dan membuka pipa saluran air, mengubah Sandman menjadi lumpur dan menghanyutkannya. Namun, perubahan sikap Peter yang semakin kasar dan egois membuat Mary Jane menjauh. Mary Jane mencium Harry dan pergi dengan perasaan sedih.
Harry, yang mendapatkan kembali ingatannya karena halusinasi ayahnya, memaksa Mary Jane untuk memutuskan Peter. Harry kemudian memberitahu Peter bahwa ia dan Mary Jane kini berpacaran. Di bawah pengaruh symbiote, Peter menyerang Harry dengan brutal, bahkan dengan kejam mengatakan bahwa ayah Harry tidak pernah mencintainya. Saat Peter pergi, Harry melempar bom labu, yang berhasil ditepis Peter namun mengenai wajah Harry, meninggalkan bekas luka mengerikan.
Di kantor Daily Bugle, Peter membongkar kebohongan Eddie Brock, fotografer saingannya yang memalsukan foto untuk menjatuhkan Spider-Man. J. Jonah Jameson, marah atas foto palsu Brock dan terpaksa mencetak ralat, memecat Brock dan mempromosikan Peter sebagai fotografer staf. Peter kemudian mengajak Gwen ke klub jazz tempat Mary Jane bekerja, dengan maksud membuat Mary Jane cemburu. Gwen, menyadari niat Peter, meminta maaf kepada Mary Jane dan pergi. Setelah terlibat perkelahian dengan penjaga klub dan tidak sengaja melukai Mary Jane, Peter menyadari bahwa symbiote telah merusaknya.
Peter mencari tempat yang sunyi di menara lonceng gereja. Ia menemukan bahwa suara dentingan logam yang keras melemahkan symbiote. Dengan susah payah, Peter berhasil melepaskan symbiote dari tubuhnya. Eddie Brock, yang menyaksikan kejadian tersebut dari bangku gereja, menjadi inang baru symbiote dan berubah menjadi Venom yang mengerikan.
Venom menemukan Sandman yang ternyata masih hidup dan meyakinkannya untuk bekerja sama membunuh Spider-Man. Venom menculik Mary Jane dan menyekapnya di puncak gedung konstruksi, berniat membalas dendam kepada Peter karena telah menghancurkan karirnya. Sandman bertugas menjaga polisi agar tidak mendekat. Harry, yang kini memiliki bekas luka di wajahnya, awalnya menolak membantu Peter. Namun, pelayan keluarga Osborn mengungkap kebenaran bahwa kematian Norman bukanlah kesalahan Spider-Man.
Saat Venom dan Sandman berhasil melumpuhkan Peter, Harry datang membantu dan menyelamatkan Mary Jane. Venom mencoba menusuk Peter dengan glider Harry, tetapi Harry melompat dan terkena glider tersebut. Teringat kelemahan symbiote, Peter mengumpulkan pipa-pipa logam di sekelilingnya dan menciptakan serangan sonik yang melemahkan symbiote, memungkinkan Peter memisahkan Brock dari symbiote.
Peter mengaktifkan bom labu dan melemparkannya ke symbiote yang tak berinang. Brock, yang telah kecanduan kekuatan symbiote, berusaha menyelamatkannya, namun keduanya hancur bersama ledakan bom. Sandman menjelaskan bahwa kematian Paman Ben adalah kecelakaan yang terus menghantuinya dan semua yang ia lakukan adalah demi putrinya. Peter memaafkan Sandman dan membiarkannya pergi. Peter dan Harry berbaikan sebelum Harry meninggal akibat luka-lukanya. Beberapa waktu setelah pemakaman Harry, Peter mengunjungi Mary Jane di klub jazz. Mereka berpelukan dan berdansa, menandakan harapan baru bagi hubungan mereka.
