Nini Thowok adalah sebuah film horor yang mengangkat legenda urban atau permainan tradisional mistis Jawa yang melibatkan boneka jelangkung versi lain, yaitu Nini Thowok. Boneka ini biasanya terbuat dari siwur (gayung tempurung kelapa), keranjang bambu, dan diberi pakaian layaknya seorang nenek, serta dipercaya bisa dirasuki roh halus untuk berkomunikasi atau bergerak sendiri. Film ini berpusat pada Nadine (diperankan oleh Natasha Wilona), seorang gadis muda yang baru saja mendapatkan warisan berupa sebuah losmen tua dari neneknya di daerah Solo, Jawa Tengah.
Bersama adiknya, Naya (Nicole Rossi), Nadine memutuskan untuk mengunjungi losmen tersebut. Setibanya di sana, mereka menemukan bahwa losmen itu tidak hanya tua dan besar, tetapi juga menyimpan banyak rahasia kelam dan memiliki atmosfer yang menyeramkan. Salah satu kamar di losmen itu ternyata sengaja dikunci rapat dan tidak pernah dibuka selama bertahun-tahun. Didorong oleh rasa penasaran, Nadine nekat membuka kamar terlarang tersebut. Di dalamnya, ia menemukan sebuah boneka Nini Thowok yang tampak tua dan menyeramkan, bersama dengan catatan-catatan aneh peninggalan neneknya.
Sejak kamar itu dibuka dan boneka Nini Thowok ditemukan, serangkaian kejadian aneh dan mengerikan mulai terjadi di losmen tersebut. Nadine dan Naya diteror oleh kehadiran gaib yang tampaknya terkait dengan boneka Nini Thowok dan rahasia masa lalu keluarga mereka. Mereka mulai menyadari bahwa warisan yang mereka terima bukan hanya bangunan fisik, tetapi juga kutukan atau arwah penasaran yang terikat pada tempat itu. Dengan bantuan beberapa orang di sekitar losmen, termasuk seorang pria lokal yang tampaknya mengetahui sejarah tempat itu (mungkin diperankan oleh Jajang C. Noer atau Slamet Ambari yang sering muncul di film horor bertema serupa), Nadine harus mengungkap misteri di balik Nini Thowok dan menyelamatkan diri serta adiknya dari teror yang semakin menjadi-jadi. Disutradarai oleh Erwin Arnada, Nini Thowok mencoba menghadirkan horor berbasis folklore Jawa dengan elemen misteri keluarga dan boneka berhantu sebagai pusat ketegangannya.
