Film Despicable Me 4 kembali membawa kita ke kehidupan mantan penjahat super Felonious Gru, yang kini menjalani peran gandanya sebagai agen Anti-Villain League (AVL) dan seorang ayah bagi tiga putri angkatnya, Margo, Edith, Agnes, serta putra kandungnya yang masih bayi, Gru Jr. Petualangan baru dimulai saat Gru menghadiri reuni di SMA lamanya, Lycée Pas Bon. Di sana, ia bertemu kembali dengan Maxime Le Mal, teman sekelas lamanya yang menyimpan dendam mendalam terhadap Gru karena merasa Gru telah “mencuri” aksi pertunjukan bakatnya di masa lalu.
Reuni yang seharusnya menyenangkan berubah tegang ketika Maxime mengungkapkan bahwa ia telah meningkatkan dirinya dengan bagian tubuh kecoak, menjadikannya ancaman fisik. Gru, bertindak sebagai agen AVL, berhasil menangkap Maxime dan menyerahkannya ke pihak berwenang. Namun, kejahatan belum berakhir. Dengan bantuan pacarnya, Valentina, Maxime berhasil melarikan diri dari penjara. Kebebasannya membawa ancaman yang lebih besar, karena Maxime kini memiliki penemuan baru: senjata ampuh yang mampu mengubah orang menjadi hibrida kecoak. Dan target utamanya adalah Gru Jr., bayi Gru yang anehnya sangat membenci ayahnya sendiri.
Menyadari bahaya yang mengintai, Silas Ramsbottom dari AVL mengunjungi rumah tangga Gru untuk menginformasikan tentang pelarian Maxime dan rencana relokasi keluarga Gru ke rumah perlindungan di kota lain di bawah identitas baru demi keamanan mereka. Sementara itu, para Minion dibawa ke fasilitas AVL. Lima Minion terpilih untuk sebuah inisiatif baru yang bertujuan memberi mereka kekuatan super, yang dikenal sebagai Mega Minions. Namun, program ini segera dibatalkan setelah Mega Minions secara tidak sengaja menyebabkan kerusakan parah di kota terdekat, meskipun mereka tetap memiliki kekuatan tersebut dan dapat dipanggil kembali jika diperlukan.
Di kota baru mereka yang makmur, keluarga Gru tinggal di rumah perlindungan dan bertemu dengan tetangga baru mereka, keluarga Prescott, serta putri remaja mereka, Poppy. Poppy, yang ternyata adalah seorang calon penjahat, mengenali Gru dari masa lalunya sebagai penjahat super. Ia mengancam akan membongkar penyamaran Gru kecuali Gru membantunya melakukan pencurian untuk mengambil maskot luak madu sekolah Lycée Pas Bon bernama Lenny. Terjebak dalam situasi tersebut, Gru setuju. Dengan bantuan dua Minion dan Gru Jr., mereka sukses mencuri Lenny dari sekolah. Sayangnya, mereka tidak menyadari bahwa kalung Lenny dilengkapi pelacak. Kepala sekolah Übelschlecht mengenali Gru melalui rekaman kamera keamanan dan segera menghubungi Maxime, memberitahukan lokasi Gru menggunakan pelacak di kalung Lenny.
Keesokan harinya, saat Gru dan Lucy pergi untuk latihan tenis, meninggalkan anak-anak perempuan dan Poppy di rumah untuk menjaga Gru Jr., Übelschlecht datang ke rumah perlindungan untuk menginterogasi mereka tentang Gru. Melihat situasi ini, Poppy segera pergi. Gru dan Lucy bergegas pulang setelah dihubungi oleh Margo, dan mereka sekeluarga bersama-sama menghadapi Übelschlecht. Lucy juga mengirimkan sinyal ke AVL, yang memanggil Mega Minions yang sudah pensiun untuk menghentikan Maxime. Di tengah kekacauan, Gru Jr. tanpa sengaja keluar dari rumah dan terlihat oleh Maxime dan Valentina, yang langsung menculiknya. Lucy dan anak-anak perempuan tinggal di belakang untuk menangani Übelschlecht sementara Gru memutuskan untuk menyelamatkan putranya, ditemani oleh Poppy.
Menggunakan mobil terbang, Gru dan Poppy mengejar kapal Maxime. Poppy membantu Gru menyusup ke kapal, dan Gru berhasil membajak kapal tersebut, menyebabkannya jatuh di atas bangunan yang sedang dibangun. Di sana, Maxime mengungkapkan bahwa ia tidak hanya menculik Gru Jr., tetapi juga telah mencuci otaknya dan mengubah penampilannya menjadi hibrida manusia-kecoak. Gru harus melawan putranya sendiri yang kini di bawah kendali Maxime. Kata-kata Gru kepada Gru Jr. berhasil memutus cuci otak tersebut, membuat Gru Jr. berbalik menyerang Maxime. Gru kemudian melayangkan pukulan kepada Maxime, membuatnya terjatuh dari gedung. Di bawah, Maxime semakin remuk setelah diinjak oleh Mega Minions dan sepasukan hewan yang tiba di lokasi. AVL kemudian tiba dan menangkap Maxime serta Valentina.
Bersatu kembali dengan Lucy dan anak-anak perempuan, keluarga Gru akhirnya kembali ke rumah asli mereka. Dr. Nefario berhasil membalikkan transformasi Gru Jr., mengembalikannya menjadi normal. Beberapa waktu kemudian, Gru mengunjungi Maxime di penjara untuk berbicara dan menyelesaikan perbedaan mereka. Keduanya bahkan tampil bersama membawakan lagu “Everybody Wants to Rule the World” di penjara AVL untuk para narapidana, disaksikan oleh penjahat-penjahat dari masa lalu. Sementara itu, Poppy diterima dan mulai bersekolah di Lycée Pas Bon, memulai babak baru dalam hidupnya.
