Film Deadpool dibuka dengan adegan aksi yang intens di jalan tol, di mana Wade Wilson, yang kini dikenal sebagai vigilante Deadpool, melakukan penyergapan terhadap Ajax dan konvoinya. Sembari baku tembak dan kekacauan terjadi, film membawa kita mundur dalam flashback yang menceritakan bagaimana Wade bisa menjadi Deadpool.
Sebelum menjadi sosok anti-hero bertopeng merah, Wade Wilson adalah mantan anggota pasukan khusus Kanada yang banting setir menjadi tentara bayaran. Kehidupannya berubah saat ia bertemu Vanessa, seorang pekerja seks. Cinta tumbuh di antara mereka, dan setahun kemudian, lamaran pernikahan Wade diterima oleh Vanessa. Kebahagiaan ini sayangnya tidak berlangsung lama. Wade didiagnosa kanker stadium akhir.
Di tengah keputusasaan, Wade didekati oleh seorang perekrut misterius yang menjanjikan pengobatan eksperimental yang bisa menyembuhkan kankernya. Demi tidak membebani Vanessa dengan penyakitnya dan melihatnya menderita, Wade memutuskan untuk pergi dan menjalani pengobatan tersebut.
Wade dibawa ke sebuah laboratorium rahasia yang dijalankan oleh Ajax dan Angel Dust. Di sana, ia disuntik serum dengan harapan membangkitkan gen mutan laten dalam tubuhnya. Alih-alih penyembuhan instan, Wade justru mengalami penyiksaan berat selama berhari-hari. Mereka melakukan berbagai metode ekstrem untuk memicu mutasi, namun hasilnya nihil.
Titik balik terjadi ketika Wade mengetahui nama asli Ajax adalah Francis. Ia mengejek Ajax dengan nama tersebut, yang membuat Ajax murka dan meninggalkannya di ruang hypobaric. Dalam ruang tekanan rendah itu, Wade disiksa dengan kondisi hampir mati lemas secara berkala selama akhir pekan. Penyiksaan ini akhirnya memicu faktor penyembuhan regeneratif dalam tubuh Wade, yang memang melawan kankernya, namun efek sampingnya mengerikan. Kulit Wade menjadi rusak parah, dipenuhi tumor seperti luka bakar di sekujur tubuhnya.
Dengan kekuatan barunya, Wade berhasil kabur dari lab dan menyerang Ajax. Namun, Ajax mengiming-iminginya bahwa kondisinya masih bisa disembuhkan. Dalam kekacauan itu, Ajax berhasil melumpuhkan Wade dan meninggalkannya dalam keadaan hampir mati.
Ajaibnya, faktor penyembuhan Wade menyelamatkannya. Ia selamat dan berusaha mencari Vanessa, namun ia ragu untuk menampakkan diri karena penampilannya yang kini mengerikan. Setelah berkonsultasi dengan sahabatnya, Weasel, Wade memutuskan untuk memburu Ajax, bukan untuk mencari penyembuhan—karena ia tahu Ajax berbohong—tapi untuk balas dendam.
Wade kemudian menjadi vigilante, mengambil nama “Deadpool” (yang diberikan Weasel berdasarkan taruhan ‘dead pool’). Ia tinggal bersama Al, seorang wanita tua buta. Selama setahun berikutnya, Deadpool menghabisi satu per satu kaki tangan Ajax, hingga akhirnya seorang perekrut membocorkan keberadaan Ajax. Informasi ini membawa Deadpool pada penyergapan di jalan tol yang menjadi pembuka film.
Di jalan tol, Deadpool berhasil melumpuhkan semua anak buah Ajax dan menghadapi Ajax langsung. Saat ia menuntut ‘obat’ yang dijanjikan, tiba-tiba muncul Colossus dan Negasonic Teenage Warhead dari X-Men. Colossus mencoba membujuk Deadpool untuk berubah jalan dan bergabung dengan X-Men, namun Deadpool menolak. Kesempatan ini dimanfaatkan Ajax untuk kabur dan menemui Angel Dust. Mereka kemudian pergi ke bar Weasel, tempat Ajax mendengar tentang Vanessa.
Ajax menculik Vanessa dan membawanya ke bangkai kapal induk Helicarrier di sebuah tempat barang rongsokan. Deadpool, dengan bantuan Colossus dan Negasonic, berusaha menyelamatkan Vanessa. Pertempuran sengit terjadi melawan Angel Dust dan anak buah Ajax, sementara Deadpool mengejar Ajax. Dalam pertempuran, Negasonic tanpa sengaja merusak struktur Helicarrier, membuatnya mulai runtuh.
Deadpool melindungi Vanessa saat kapal runtuh, sementara Colossus menyelamatkan Negasonic dan Angel Dust. Akhirnya, Deadpool kembali berhadapan dengan Ajax. Meski Colossus memohon untuk tidak membunuh, Deadpool yang marah dan kecewa membunuh Ajax setelah Ajax mengakui bahwa ‘obat’ yang dijanjikannya tidak pernah ada.
Vanessa marah pada awalnya karena Wade meninggalkannya, namun kemarahannya reda setelah melihat wajah Wade yang rusak dan memahami alasannya. Mereka akhirnya berbaikan.
Di adegan post-credits, Deadpool meniru adegan post-credits film Ferris Bueller’s Day Off, mengatakan bahwa mereka hanya punya cukup uang untuk mengumumkan bahwa Cable akan muncul di sekuelnya, dan memberikan beberapa saran aktor untuk peran tersebut.
