Captain America: The Winter Soldier, Dua tahun setelah pertempuran dahsyat di New York, Steve Rogers, atau yang lebih dikenal sebagai Captain America, kini bekerja untuk S.H.I.E.L.D., sebuah badan mata-mata rahasia di Washington, D.C. Sambil mencoba beradaptasi dengan kehidupan modern, Steve menjalani berbagai misi bersama rekan agennya, Natasha Romanoff atau Black Widow.
Dalam sebuah misi pembebasan sandera di atas kapal S.H.I.E.L.D. yang dibajak oleh kelompok bajak laut pimpinan Georges Batroc, Steve merasa ada yang janggal. Ia mendapati bahwa Natasha memiliki agenda tersembunyi, yaitu mengunduh data penting dari komputer kapal.
Kembali ke Triskelion, markas besar S.H.I.E.L.D., Steve menemui Direktur Nick Fury untuk mempertanyakan misi ganda Natasha. Fury kemudian menjelaskan tentang Proyek Insight, sebuah inisiatif ambisius yang melibatkan tiga Helicarrier yang terhubung dengan satelit mata-mata. Proyek ini dirancang untuk melenyapkan ancaman sebelum mereka sempat terjadi. Namun, Fury sendiri mulai curiga dengan Proyek Insight, terutama karena ia tidak bisa membuka enkripsi data yang diunduh Natasha. Ia meminta Alexander Pierce, seorang pejabat tinggi S.H.I.E.L.D. dan Menteri Keamanan Dalam Negeri, untuk menunda proyek tersebut.
Saat dalam perjalanan menemui Maria Hill, Fury disergap oleh sekelompok penyerang yang dipimpin oleh seorang pembunuh misterius yang dikenal sebagai Winter Soldier. Berhasil lolos dan mencapai apartemen Steve, Fury memperingatkannya bahwa S.H.I.E.L.D. telah dikompromikan. Namun, sebelum sempat menjelaskan lebih lanjut, Winter Soldier menembak Fury. Dalam kondisi sekarat, Fury sempat memberikan sebuah flash drive berisi data dari kapal kepada Steve. Fury dinyatakan meninggal saat operasi, dan Maria Hill mengambil jenazahnya.
Pierce memanggil Steve ke Triskelion. Ketika Steve menolak memberikan informasi yang Fury berikan, Pierce justru menuduhnya sebagai buronan. Dikejar oleh tim S.T.R.I.K.E. bentukan S.H.I.E.L.D., Steve bertemu kembali dengan Natasha. Mereka menganalisis data dari flash drive dan menemukan sebuah bunker rahasia S.H.I.E.L.D. di New Jersey. Di sana, mereka mengaktifkan superkomputer yang berisi kesadaran Arnim Zola yang diawetkan.
Zola mengungkapkan fakta mengejutkan: setelah ditangkap oleh Steve saat Perang Dunia II, ia direkrut oleh S.H.I.E.L.D. Tanpa disadari, Zola secara diam-diam membangun kembali organisasi Hydra di dalam tubuh S.H.I.E.L.D. Hydra menggunakan Winter Soldier sebagai mesin pembunuh utama mereka, menebar kekacauan global untuk mencapai tujuan jahat mereka. Steve dan Natasha nyaris tewas ketika bunker tersebut dihancurkan oleh rudal S.H.I.E.L.D., dan mereka menyadari bahwa Alexander Pierce adalah pemimpin Hydra di dalam S.H.I.E.L.D.
Steve dan Natasha meminta bantuan Sam Wilson, seorang veteran dan mantan anggota USAF pararescueman yang bekerja di VA dan telah menjadi teman baik Steve. Mereka mendapatkan paket sayap “Falcon” bertenaga yang pernah digunakan Sam di Angkatan Udara. Bersama, mereka menangkap Jasper Sitwell, seorang agen S.H.I.E.L.D. yang ternyata adalah mata-mata Hydra. Sitwell mengungkapkan bahwa Zola mengembangkan algoritma penggalian data yang mampu mengidentifikasi individu yang berpotensi menjadi ancaman bagi Hydra di masa depan. Helicarrier Insight akan digunakan untuk melenyapkan jutaan orang yang dianggap sebagai potensi ancaman tersebut.
Sitwell tewas dalam serangan Winter Soldier. Steve terkejut menyadari bahwa Winter Soldier adalah Bucky Barnes, sahabat lamanya yang dianggap telah meninggal. Bucky ternyata selamat berkat eksperimen Zola dan telah dicuci otak serta dibekukan berulang kali untuk menjalankan misi Hydra. Hill berhasil membawa ketiganya ke rumah aman, tempat Fury yang ternyata memalsukan kematiannya merencanakan sabotase Helicarrier dengan mengganti chip pengendali mereka.
Saat para anggota Dewan Keamanan Dunia tiba untuk peluncuran Helicarrier, Steve menyiarkan rencana jahat Hydra ke seluruh Triskelion. Natasha, menyamar sebagai salah satu anggota dewan, melumpuhkan Pierce. Fury tiba dan memaksa Pierce membuka kunci database S.H.I.E.L.D. agar Natasha dapat membocorkan informasi rahasia, membongkar Hydra ke publik. Setelah perkelahian singkat, Fury menembak mati Pierce. Steve dan Wilson menyusup ke dua Helicarrier dan mengganti chip pengendali. Namun, di Helicarrier ketiga, Bucky menghancurkan suit Falcon milik Wilson dan bertarung dengan Steve. Steve berhasil melumpuhkan Bucky dan mengganti chip terakhir, memungkinkan Hill mengambil kendali dan memerintahkan Helicarrier untuk saling menghancurkan.
Steve menolak melawan Bucky, berusaha menjangkau sahabatnya. Namun, saat Helicarrier bertabrakan dengan Triskelion, Steve jatuh ke Sungai Potomac. Secara mengejutkan, Bucky menyelamatkan Steve yang tidak sadarkan diri sebelum menghilang ke hutan. Dengan S.H.I.E.L.D. yang berantakan, Natasha tampil di depan subkomite Senat untuk membela tindakannya dan Steve. Fury, yang masih dianggap mati, pergi ke Eropa untuk memburu sel-sel Hydra yang tersisa. Steve dan Wilson memutuskan untuk mencari Bucky, sementara Rumlow, yang ternyata juga agen Hydra, dirawat di rumah sakit setelah kehancuran Triskelion.
